介绍单细胞提取的三种方法

　　单细胞测序已逐渐成为科研热点，它解决了用组织样本测序或样本少时无法解决的细胞异质性难题,为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向。但是单细胞测序遇到的第一个难题就是:"如何获取单细胞?”

　　1.有限稀释法(Limiting Dilution)有限稀释法是根据细胞悬液浓度的计算,逐步稀释得到一定体积内只有1个或少量细胞的方法(一般为1 ul,多数WGAWTA试剂盒可容纳投入体积)。该访法操作简单，无需特殊设备。但是，由于分选基于浓度计算，无法直接观察，容易出现错误。

　　2.显微操作法(Micromanipulator)

　　显微操作法是将细胞悬液置于显微镜下进行单细胞挑选的方法，细胞挑选过程更直观。低配版显微操作，可以使用口吸管(英文名:Aspirator tube assembly)来进行;如果有经济实力的客户，可以使用显微操作台进行操作。首先，需要将细胞悬液进行稀释,浓度在20个细胞每微升为宜。吸取细胞时，细管内不能有太多的缓冲液,保证毛细管内液体在1ul左右。然后将毛细管内液体吹入反应管中,反应管中预先加入的4 u|裂解液,这一过程切忌产生气泡。显微操作的优势在于能够准确地控制单细胞的吸取与释放;其缺点在于通量低，对操作人员的技术要求高。

　　3.荧光流式分选(FACS)

　　荧光流式分选能够很好的实现大量细胞的分选过程，齟能够做到精度高、通量大。但是它要求的细胞数量多,需要的样本初始体积较大，使一些小体积或微量样本(如细针穿刺液)分离细胞受到了制约。该访法需要配备具有分选功能的流式细胞仪。在进行流式分选的过程中，需要先将样本制成细胞悬液。不同形式的样品，制作细胞悬液的方法也有所不同。

　　我们最为常见的样本类型有:新鲜实体组织、外周血单核细胞(PBMC)及培养细胞等。中，新鲜实体组织需要经过酶解法、机械法或者化学处理法等方法进行细胞分散，制作细胞悬液。在制作细胞悬液的过程中需要注意:①无菌操作;②操作过程要迅速;③染色和固定避免对细胞产性伤害;④在分选前进行细胞计数和活性统计。