单分子追踪助力Nature子刊！整合素相互作用蛋白的功能与作用机制研究

研究背景：

FERM结构域的蛋白家族中，黏着斑蛋白（kindlin）和踝蛋白（talin） 是进化上高度保守并且在FERM结构域中表现出高度同源性。kindlin家族在整合素（integrin）活化中发挥重要作用，参与integrin的双向信号传导，对整合素受体介导的细胞与细胞外基质的黏附、细胞-细胞外基质的黏附、细胞迁移、胚胎发育、损伤修复等过程中发挥关键作用。此外kindlin的异常还可以导致多种遗传性疾病的发生，同时kindlin家族作为重要的信号分子还参与了肿瘤的发生发展过程。

近日，《Nature Communications》刊登了Grégory Giannone等学者的新研究成果，该团队使用Abbelight 3D单分子超分辨成像系统SAFe 360的超分辨-单分子追踪技术（SPT-PALM）研究了kindlin和talin等蛋白在细胞质膜中的扩散机制。

研究内容：

焦点黏着斑蛋白（FAs）家族广泛参与整合素依赖型细胞粘附、性和迁移等过程，通过直接或间接的方式结合在细胞外基质（ECM）和肌动蛋白细胞骨架之间，并与具有不同结构、信号或支架功能的蛋白建立物理联系。然而FAs蛋白如何被引导到定的纳米层以促进与定靶点的相互机制目前尚不清楚。为探究其机制，Grégory Giannone等将kindlin的蛋白分子行为和3D纳米定位与其在FAs内integrin激活中的功能联系起来，通过单蛋白追踪、超分辨成像以及功能分析kindlin在上膜的定位和扩散对integrin激活、细胞扩散和FAs形成过程，并通过研究发现kindlin通过与talin不同的途径来达到和激活integrin，为integrin激活期间的互补性提供了可能的分子基础。

，作者通过追踪integrin在细胞中不同区域的单分子运动轨迹，计算单个β1-integrin或者β3-integrin分子的扩散系数，并比较integrin在FA内和FA外的扩散系数，发现integrin在FA中有自由扩散（绿色轨迹），被束缚的区域扩散（黄色轨迹）和固定不动三种不同模式。不同的细胞中，integrin在FA外普遍表现出更快的扩散速度，更多倾向于纯自由扩散。同时Mn²⁺的处理会让更多的integrin分子倾向于固定不动，也即参与同kindlin和或talin相互作用。经过计算kindlin突变体和talin突变体中β1-integrin或者β3-integrin的扩散系数并比较，发现对于这两个突变体，Mn²⁺处理结果略有不同，kindlin突变体中integrin分子倾向于固定不动的比例相对于talin突变体较低些。

integrin，kindlin和talin在细胞中的扩散的轨迹分布于扩散系数分布

为了进步分析kindlin和talin与integrin相互作用的机制，观测比较kindlin和talin单分子扩散轨迹可发现integrin和kindlin通过细胞膜自由扩散立进入焦点黏着斑（FAs），而talin和paxillin通过胞浆自由扩散到达FAs。在FAs中integrin展现自由扩散和被束缚的扩散两种扩散模式，两种模式都是通过kindlin和talin的结合触发。自由扩散时integrin，kindlin和talin同时以正确的取向结合的概率非常低，Grégory Giannone等学者研究显示三者更倾向于如上图所示的模型，也即在质膜上自由扩散的integrin和kindlin会形成不可移动的integrin-kindlin复合物(i)；这种复合物可以限制整合素β端的方向，并有于talin与近端NPxY基序的结合，从而形成短暂integrin-kindlin-talin的三元复合物(ii)；kindlin可以间歇性地解离(iii)并再次(ii)与寿命更长的integrin-talin复合物重新结合。这种瞬态的integrin-kindlin-talin三元复合物的相互作用会大大延长integrin和talin的相互作用的持续时间。talin和kindlin脱附后integrin会继续恢复自由扩散的模式，直至再次和kindlin结合。

kindlin和talin激活整合素的示意图模型

实验设备简介：

本实验中实用的单分子示踪系统是abbelight公司研发的3D单分子定位显微系统—SAFe 360，用其有的DAISY技术将xyz方向的定位精度提高至15 nm，可以精确观测蛋白颗粒的定位分布及其运动轨迹。除此之外，该设备还具备大视场和键式操作，能够大幅度降低单分子定位操作技术的门槛，帮助研究者从事分子机制的研究。

典型采集实例：

神经元超分辨成像	大肠杆菌	线粒体三维结构	外泌体成像

参考文献：

[1] Orré, Thomas, et al. "Molecular motion and tridimensional nanoscale localization of kindlin control integrin activation in focal adhesions." Nature communications 12.1 (2021): 1-17.

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