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无需纯化的病毒表征系统! 全自动病毒荧光检测分析系统

发布时间: 2022-05-09  点击次数: 326次

在基因治疗域,慢病毒载体(Lentivirus)是种复制较慢的逆转录病毒,由HIV-1改造而来,常作为基因治疗的载体使用。


慢病毒载体的制备流程需要对病毒的物理滴度和感染滴度进行检测。


1. 现有的检测手段(如p24 ELISA)因·病毒中p24蛋白的含量不同、含有p24蛋白的杂质(如外泌体)等因素的影响,无法精准地表征病毒的物理滴度,且此类方法均无法对空载病毒(无p24蛋白)进行表征,这就给感染滴度的检测带来了误差。

2. 在复杂的病毒工业化制备流程中,只测量末端纯化产品的滴度,无法真实反映各个生产环节的生产效率,而对各个生产环节的样品都进行纯化表征会浪费大量人力物力。目前研究者亟需种无纯化、快速、检测下限低的病毒表征手段。

3. 目前的病毒表征手段,均无法将病毒的物理参数如粒径(与载体聚合相关)与蛋白质组分析联系起来。因此,这些技术无法分析病毒滴度受样品聚集或病毒破裂与分解影响的情况,因此无法区分单分散制剂与聚集样品。

                                             

对于上述问题,美国NanoView公司所开发的全自动病毒荧光检测分析系统是款无需纯化的、全自动的可对病毒进行表征分析的全新设备。该设备能够提供全·方位的病毒表征信息,包括病毒粒径、病毒表面和内部病毒蛋白、病毒物理滴度、空载比检测、病毒转导效率及假型定量表征等。操作简单,结果可靠。



全自动病毒荧光检测分析系统的基本原理是种基于异性免疫捕获技术,允许研究者直接分析定群体的病毒。通过配套的试剂盒,客户次性能够分析多达16个不同的样本,大大节省了时间和经济成本。


和传统的病毒表征手段相比,全自动病毒荧光检测分析系统有如下



 


  • 无需纯化

NanoView的LentiView™技术可以对慢病毒进行检测,将蛋白质组信息与物理病毒滴度结合起来,无需样品纯化。只需 35 µl 未纯化或纯化的样品,检测浓度低至106VP/ml。无需担心纯化带来的误差,更精确地测量样品间的表征和表达信息的差异。



慢病毒示意图

 

  • ·方位的病毒粒径分析

全自动外泌体荧光检测分析系统能够对>20 nm的病毒进行全方面的表征,无论是粒径分布、空载病毒与完整病毒的假型分析均可在次测试中得到。并且所用来测试的样本无需进行纯化,避免因纯化带来的样本偏差。

 

  • 病毒滴度

病毒物理滴度的·常用检测方法是p24 ELISA。该方法测量p24衣壳蛋白的浓度并将其转化为病毒物理滴度。样品中溶解的p24、不同病毒p24含量的不同以及病毒聚集会影响检测准确性。此外, p24 ELISA无法检测缺少衣壳(空载)的颗粒。LentiView™可对样品中病毒进行高灵敏度的定量检测,获得滴度数据,区分完整和空载病毒并识别样品中杂质如可能经过纯化带有的外泌体等。

 



红色荧光抗体标记病毒的内部p24衣壳蛋白,用蓝色荧光抗体标记VSV-G,同时表达p24和VSV-G的病毒显示粉红色,并由 NanoView用软件计数。

 

  • 完整/空载病毒颗粒的比例

NanoView的LentiView™技术可以简单快速地分析出完整/空载病毒颗粒的比例,区分完整(成功转导)和空载病毒并识别样品中杂质,而完整/空载病毒颗粒的比例是确定转导效率的主要依据。

 


 


完整病毒是表达VSV-G和/或ETL,且表达衣壳蛋白p24的病毒颗粒,空载病毒是表达VSV-G和/或ETL,未表达衣壳蛋白p24的病毒颗粒

 



LentiView™芯片表面固定的抗VSV-G抗体捕获病毒后,即可检测表面和内部蛋白标记物。在LentiView™获得荧光图像中,绿色荧光点代表没有衣壳的VSV-G+病毒颗粒,黄色荧光点代表含有衣壳的完整病毒颗粒。

 

  • 病毒转导效率

我们使用LentiView™对三种不同的慢病毒样品进行了表征,检测病毒颗粒亚群,进而研究这些载体的转导效率。三种不同的慢病毒样品分别为野生型慢病毒 (VSV wt)、含高浓度质粒的工程化靶向配体 (ETL-HC)、含低浓度质粒的工程化靶向配体 (ETL-LC)。




三种慢病毒载体的转导效率

 


转导效率与物理滴度的对比

 

根据病毒碎片粒径和病毒粒径的差别,对每种载体中的病毒和病毒碎片数量进行统计。50nm以上的病毒与50nm以下的病毒碎片的比例和载体的转导效率之间存在很强的相关性。




载体转导效率和病毒与病毒碎片比例的对比

 

  • 完全定制化

客户通过ViroFlex技术使用连接蛋白连接任意定制化的捕获抗体,并结合到ViroFlex芯片表面进而捕获所需的病毒,在自己的实验室里轻松进行高度定制化的检测。

 


ViroFlex的芯片捕获抗体排布示意图

 

 

ViroFlex定制化检测原理:

  • 将连接蛋白与所需的定制抗体连接

  • 再将连接抗体的连接蛋白与ViroFlex芯片表面的连接蛋白抗体连接

  • 所需的定制抗体从而结合到了芯片上

  • 将样品在芯片上孵育,定制抗体即可异性捕获病毒

  • 每个芯片多可结合两种定制化捕获抗体



ViroFlex芯片的捕获原理(左)与普通芯片的捕获原理(右)示意图

 

ExoViewTM参数信息:

  • 颗粒大小分辨范围:20nm

  • ·低检测浓度为106 VP/mL

  • 所需样本体积:35 μL

  • 激发波长:410 nm,488 nm,555 nm,640 nm,750nm

  • 可次检测16个样本,每个样本可同时检测6个不同亚型及4种生物标记的荧光定位

  • 捕获抗体:个芯片多允许6种捕获抗体(+阴性对照)

  • 荧光通道:4个荧光通道


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