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全自动外泌体荧光检测分析技术助力科学家开发出种有效鼻腔新·冠疫苗

更新时间:2022-03-16点击次数:856

新·冠疫情爆发以来,多种不同的疫苗(mRNA疫苗、慢病毒疫苗、灭活病毒等)在全·的抗疫中发挥了重大作用。然而现有的疫苗也有些局限性,如储存运输条件苛刻、需要接种加强针、对突变病毒不敏感等等。近,bioRxiv发表了篇基于细菌外泌体的新型新·冠疫苗对疾病保护作用的文章,或许可以为新·冠疫苗的研发提供新的思路。


Jiang和Driedonks等[1]通过对细菌来源的外囊泡表面修饰病毒S蛋白的受体结合结构域(RBD)制成了新型新·冠疫苗。革兰氏阴性菌能够产生外膜囊泡(OMV),在哺乳动物体内具有免疫刺激作用,可诱导免疫应答发生并激活树突细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞,而经过改造的工程菌产生的OMV内毒性非常低,避免了不良反应的发生。作者使用了种鼠伤寒沙门氏菌株,通过Spycatcher/Spytag体系使该菌株分泌的OMV通过共价键稳定结合了病毒的RBD(图1)。


图1 (A)RBD重组抗原的设计,RBD连接到SpyTag的N端和C端;(B)RBD修饰的OMV示意图。


研究人员在RBD-OMV制备完成后,使用全自动外泌体荧光检测分析系统Exoview检测OMV表面是否成功结合了病毒RBD。其中,检测芯片上包被了D001, D003, MM43三种病毒S蛋白以及LPS的抗体,分别用于捕获RBD-OMV和所有OMV;捕获完成后使用荧光抗体标记对D001, D003, MM43进行表型分析。后,使用Exoview的SP-IRIS无标记成像技术检测了OMV是否被成功捕获,并通过荧光成像统计捕获的不同表型OMV的数量



图2 RBD-OMV捕获数量及表型检测。A:SP-IRIS技术检测不同抗体捕获的OMV数量;B:荧光检测不同表型OMV数量。

 


图3 对照组捕获数量及表型检测。A:SP-IRIS技术检测不同抗体捕获的OMV数量;B:荧光检测不同表型OMV数量。


 


图4 RBD-OMV与对照组的捕获的不同表型OMV数量对比。

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图2A显示S蛋白抗体和LPS抗体均捕获到了数量相当的OMV,表示OMV以很高的效率成功结合了新·冠病毒的RBD。图2B的荧光标记结果也证明了结合成功,但是结合D003的OMV数量相对较低。图3A和图3B的对照组结果表示仅有LPS抗体能够捕获到OMV,并且几乎没有荧光标记,表面对照组OMV上没有结合RBD,将RBD-OMV与对照组的数据统计对比(图4),说明RBD-OMV疫苗的异性非常好。

 

RBD-OMV疫苗制备完成后,研究人员使用仓鼠模型对疫苗接种的效果进行了检测。实验分为三组:接种疫苗的实验组(RBD-OMV),接种溶剂的溶剂对照组(mock)和接种未结合RBD的OMV的空白对照组(Ctrl-OMV)。研究人员对不同组别分别接种后,使用病毒感染仓鼠,并进行了系列测试以验证疫苗效果。



图5 RBD-OMV与mock、Ctrl-OMV的体重。A&B:接种完成后,病毒感染前的体重记录;C&D:病毒感染后的体重变化。

 

体重检测结果显示,在病毒感染前,三组仓鼠的体重,无论雄性和雌性,随时间均没有显著改变(图5A&B);病毒感染后,RBD-OMV组体重没有下降,而mock与Ctrl-OMV组体重下降,在第三、四天达到显著(图5C&D)。


 


图6 A:接种后Day42的抗S-RBD IgG滴度;B:抗S-RBD   IgG滴度随时间的变化;C&D&E:Day48的BAL中抗S-RBD   IgG/IgM/IgA的滴度;F:病毒中和抗体测试的中和抗体滴度随时间的变化;G:Day35 WT和Delta病毒株的中和抗体滴度比较。

 

血浆S-RBD IgG滴度测试结果显示,接种后42天,RBD-OMV组的血浆S-RBD   IgG滴度更高,而两个对照组的滴度位于检测限度以下(图6A)。为检测呼吸道黏膜的抗体水平,研究人员检测了肺泡灌洗液(BAL)的抗体滴度,RBD-OMV组中可检测到IgG/IgM/IgA,两个对照组则未检测到。中和抗体测试表明,WT病毒株感染的抗体滴度与14天开始上升,于28天达到峰值并可保持到35天(图6F);抗体的中和活性在Delta和WT中没有显著差异(图6G)。


 


图7A:肺部组织中的病毒滴度;B:BAL中的病毒滴度

 

TCID50检测结果显示,肺部组织(图7A)和BAL(图7B)中RBD-OMV组病毒滴度显著低于两个对照组,BAL组已达到检测·低限度。

 


图8 A:Day48不同组别仓鼠的肺部形态;B&C:H&E染色结果及病变积分。

 

于48天处死仓鼠并分离肺部,肉眼观察可见RBD-OMV组的炎症和出血病灶少于两个对照组,具有更少的肺泡水肿(图8A);肺组织切片的H&E染色结果也显示,RBD-OMV组的炎症、出血病灶和肺泡萎陷更少,且雄性的病变积分更低(图8B&C)。

 

以上所有检测结果表明,这种RBD-OMV疫苗可诱导抗体分泌,分泌的抗体能够中和野生型和Delta亚种病毒,证明了疫苗具有保护作用。OMV等外泌体疫苗具有如下势

  • 产量高:细菌复制快,且能够大量分泌OMV;

  • 多功能:表面可修饰多种抗原;

  • 组分构成简单:疫苗不需要其他佐剂;

  • 稳定性高:在室温下也能够保持稳定,可以冻干粉末的形式在低温长期保存。




以上结果说明,基于OMV的外泌体疫苗具有广泛的应用前景,可作为阻断新·冠肺炎以及其他传染病传播的有效手段。

 

在这项研究中,作者使用Exoview系统对结合了重组RBD的OMV进行了表征分析,确定OMV上成功结合了新·冠病毒的RBD。Exoview在外泌体疫苗开发中,可快速准确地表征外泌体,并统计不同表型外泌体数量并计算其比例,适合作为多组分外泌体疫苗的标准检测手段

 

   




参考文献:

 

[1]. Linglei Jiang, Tom Driedonks, Maggie Lowman,   Wouter S.P. Jong, ... & Kenneth W. Witwer. (2021). A bacterial   extracellular vesicle-based intranasal vaccine against SARS-CoV-2 protects   against disease and elicits neutralizing antibodies to wild-type virus and   Delta variant. bioRxiv. .


全自动外泌体荧光检测分析系统(ExoView R100)简介




作为外泌体表征分析的倡·导者,美国NanoView Biosciences于2018年推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView,该系统经推出,便引起了外泌体域科研工作者的广泛关注,凭借其稳定、出色的性能,短短几年在全球已有近百个客户,发表文献100多篇。ExoView的精准表征,能够帮助科学家更深入地了解外泌体与疾病之间的关系,助力疾病诊断和新药开发。

 

Nanoview所开发的全自动外泌体荧光检测分析系统(ExoView R200)采用单粒子干涉反射成像传感器(SP-IRIS)技术,是款无需纯化的全自动的新型外泌体表征设备。该设备能够提供全·方位的外泌体表征信息,包括颗粒大小、计数、表型与生物标志物共定位等,提供多层次和全面的外泌体测量解决方案。


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