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亚微米光学光热红外技术O-PTIR——互补传统拉曼光谱技术

发布时间: 2021-09-26  点击次数: 513次

拉曼光谱技术

近年来,拉曼光谱和成像技术, 得益于其相对于红外光谱技术异的空间分辨率等势,在研究样品的分子振动方向得到了广泛的应用,尤其是生物样品,因为水中的拉曼光谱背景信号更弱。相干拉曼散射显微技术(Coherent Raman scattering microscopy)近些年也得到了大力的发展,其基于相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering)或受激拉曼散射(stimulated Raman scattering),大大改善拉曼的成像速度。例如,蛋白质和脂肪在皮肤内的分布情况,可以通过两者在C-H伸缩振动区征的拉曼谱带进行视频的高速成像来获得。

然而拉曼光谱和成像技术也存在着自身的些不足:

(1)较低的拉曼散射截面,尤其是在指纹区,相对于红外技术弱5-10倍;

(2)会受到荧光的干扰,由于拉曼信号偏弱,些样品的荧光信号又宽又强,会定程度上覆盖拉曼信号;

光学光热红外技术

基于光学-光热红外技术(O-PTIR)的亚微米分辨率红外拉曼同步测量系统mIRage,使用宽可调谐的脉冲红外激光源激发样品,在样品中产生调制光热效应。通过光热效应提取并计算红外吸收, 通过检测反射探头光束强度的变化作为红外波数调谐的函数,从而提供红外吸收光谱。这种短波长脉冲探测光束(通常是532 nm)决定了红外测试空间分辨率,而不是传统FTIR/QCL显微镜中依赖的红外波长。由于其*的系统架构,短波长探测光束同样也能作为个拉曼激光源,当集成拉曼光谱仪,mIRage系统可以提供同地点,同时间,同空间分辨率的亚微米红外+拉曼显微镜的检测结果。

mIRage光谱的显著势:

1. 和拉曼光谱致的亚微米空间分辨率,比传统FTIR/QCL显微镜提高30倍,达到500 nm;

2. 非接触式测量,非破坏性,反射(远场)模式测量,无须复杂的样品制备;

3. 高质量光谱(测试可兼容粒子形状/尺寸和表面粗糙度),没有色散/散射伪影问题;

4. 可直接在商业数据库中匹配搜索

5. 可实现红外和拉曼光谱成像同步测量

单细胞光谱与成像——拉曼光谱技术 vs.光学光热红外技术

如上文所述,拉曼散射的横截面在指纹区相对于红外弱五到十倍,即相比于拉曼散射,红外吸收在指纹区域比在高波数C─H和O─H拉伸区有更大的横截面。以PMMA为例,C-H振动模式在3.39 μm的线性吸收系数为1396 cm−1,而在指纹区域,C=O拉伸振动模式在5.78 μm的线性吸收系数可达到7904 cm−1,约高6倍。PMMA的红外光谱和拉曼光谱的直接对比如下所示。指纹区域较大的红外吸收截面可以允许mIRage显微镜对单病毒进行振动光谱的检测分析,而这对拉曼或相关拉曼光谱来说十分困难。在相同的激光功率和采集时间下,mIRage中红外显微镜比拉曼光谱具有更高的信噪比,进步可以用于检测细菌对抗生素红霉素等药物的反应。综上所述,两种振动光谱技术并没有相互竞争,而是提供了互补的信息,现在越来越多的趋势倾向于同时获取拉曼光谱和红外光谱来全面研究样品的分子振动信息。


参考文献:

Bond-selective imaging by optically sensing the mid-infrared photothermal effect,Sci. Adv. 2021; 7 : eabg1559.



具体案例:

1. 同位素标记的大肠杆菌单细菌细胞的mIRage显微红外谱图与成像

近期,英国物浦大学Roy Goodacre教授分享了关于同位素标记的细菌的振动光谱研究成果。该研究借助于单细胞亚微米分辨率红外拉曼同步测量系统mIRage,通过红外光谱和成像分析,来揭示细菌代谢的过程和机理,不仅包含细菌群落,还包含微生物之间的相互作用。由于传统显微红外光谱仪的空间分辨率较低,目前多数研究都集中在细胞群落的评估上,而该研究作为个重大的突破,次使用亚微米光热红外光谱技术在单细胞水平上评估细菌对标记化合物的吞并行为过程。

 


参考文献:

Imaging Isotopically Labeled Bacteria at the Single-Cell Level Using High-Resolution Optical Infrared Photothermal Spectroscopy,Anal. Chem. 2021, 93, 6,3082-3088.

2. mIRage显微红外谱与Raman光谱协同分析固定或活的单细胞

英国曼彻斯大学的Peter Gardner教授近期发表了他们关于活(和固定)细胞振动光谱分析的新研究结果。他们使用亚微米分辨的mIRage红外光谱及拉曼显微镜,并借助于两个激发源(QCL和OPO激光器),对细胞进行了宽光谱范围的覆盖,从而使所有与生物学相关的分子振动都能被检测到,且保持致的亚微米的空间分辨率。此外,红外光谱采集与拉曼光谱有效的结合起来,在相同的激发位置,形成振动互补,得到套完整的振动光谱信息。如下图所示,该红外和拉曼的组合方式可以用来分析液体环境中固定或活细胞的亚细胞结构,其中的蛋白质二次结构及富脂体均可以在亚微米尺度上被有效地识别出来。



参考文献:

Analysis of Fixed and Live Single Cells Using Optical Photothermal Infrared with Concomitant Raman Spectroscopy,Anal. Chem. 2021, 93, 8, 3938–3950.

3. 亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage用于微塑料鉴定等相关域

美国拉华大学Isao Noda教授课题组与Photothermal Spectroscopy Corp公司合作,用基于光学光热红外技术的新代非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage对聚乳酸(PLA)和聚羟基烷酸酯(PHA)的复合薄片进行红外拉曼同步成像分析,探究这两种材料结合的方式和内在机理。为探求界面处PHA/PLA组分的空间分布规律,同步和异步二维相关光谱(2D-COS,two-dimensional correlation spectroscopy)被用来分析羰基拉伸区域采集到的红外谱图。结果显示,在主要为PHA的混合界面区域同时观测到来源于PLA的1760 cm-1红峰外,表明部分PLA渗透到PHA层,且与PHA层的其余部分相比,界面附近的PHA结晶度明显降低。另外,作者还通过mIRage对该区域进行了同步红外和拉曼分析,两者选择性和灵敏度不同却可以很好的互补,进步验证了这发现的可靠性。结果证实,即使是表面上不混相的PHA和PLA聚合物对,也存在定程度的分子混合,这种混合可能发生在界面只有几百纳米的空间水平上,很好的解释了这两种生物塑料之间的高度相容性。



参考文献:

Two-dimensional correlation analysis of highly spatially resolved simultaneous IR and Raman spectral imaging of bioplastics composite using optical photothermal Infrared and Raman spectroscopy,Journal of Molecular Structure, DOI: 10.1016/j.molstruc.2020.128045.

总结

亚微米分辨红外拉曼同步测量系统mIRage作为种新型的红外光谱技术,具有传统FTIR显微镜不可比拟的点,并克服了许多限制。,mIRage可以提供空间分辨率约为500 nm的红外谱图,远远超过了典型的红外衍射限空间分辨率,且不依赖于入射红外波长。更重要的是,它能够以反射/非接触(远场)工作模式简单快速的生成高质量的类似于FTIR的谱图,从而避免了制备样本薄切片的必要,且光谱与商用FTIR数据库搜索完全兼容和可译。另外,即使样品中包含易产生荧光干扰的组分(压制拉曼信号或造成其饱和),mIRage的可调制信号收集性也确保它完全不受任何荧光的影响。IR和Raman在mIRage方法的结合下,可以充分用这两种互补性技术的势,实现同步的红外吸收和拉曼散射测量,并相互印证。

相关产品:

非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统


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