技术文章 / article 您的位置:网站首页 > 技术文章 > 单细胞组学研究的里程碑式进展——活细胞单细胞测序技术

单细胞组学研究的里程碑式进展——活细胞单细胞测序技术

发布时间: 2021-05-10  点击次数: 310次

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行,而细胞状态在这操作中不可避免的会发生改变,因此很难掌握细胞真实的基因表达情况,尤其对于基因通路上表达变化的检测为不。近期苏伊士理工大学使用FluidFM创建了种原位活细胞基因测序方法,这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序,并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。

1. Live-Seq测序技术简述

由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序,该团队使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件,该团队采用了将缓冲液吸入探针,然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够很快与缓冲液混合,从而避免RNA的降解。通过这方法,该团队成功实现了IBA细胞的测序,证明了这种方法的可行性(图1)。

 

图1. Live-Seq技术

a. Live-Seq技术的示意图和代表图片,黑色箭头指代液面;b. IBA细胞测序的质量控制图(n=10)。

 

2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态
 

为了证实Live-Seq的有效性,该团队对多种细胞系进行了测序,这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞(ASPCs)以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现,该方法能够区分上述细胞系,并且在征基因检测中能够找到每种细胞所对应的征基因,证明了Live-Seq方法的有效性(图2)。

 

图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态

a. 实验方法示意图,使用LPS和PBS对RAW细胞进行处理;b. 前500个高度易变基因的tSNE图;c.1~10的细胞型、细胞状态差别基因的热图;d. 小鼠基因图谱预测,使用1~100个标记基因的团簇;e. Live-Seq对比scRNA-Seq的锚点分析,显示两者没有显著差异。

 

3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响
 

Live-Seq技术的显著势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现,提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察,发现细胞的形态基本没有改变,并且多数细胞仍然能够正常分裂(图3)。

 

图3. Live-Seq对细胞活力的影响

a. 细胞实验的示意图;b. Live-Seq测序后不同时间点(1h,4h)的scRNA-Seq的tSNE图;c.不同时间点scRNA-Seq所有能够发现差异的基因(共12个);d.不同时间点的细胞形态图片。

 

4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件
 

由于Live-Seq对细胞生理状态影响小,因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验发现,Live-seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化,因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达为相关。这结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的势。

 

图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析

a. 实验示意图;b. 不同处理细胞的mCherry强度变化;c. 3~7.5h之间mCherry强度变化;d. Tnf-mCherry强度变化的线性回归模型;e. Nfkbia与Tnf在Live-Seq测序中的表达关系;f. Nfkbia与Tnf在scRNA-Seq测序中的表达关系;g. Live-Seq测序中细胞处于S期的评分;h. Live-Seq测序中细胞周期的mTnf-mCherry强度变化;i.Tnf-mCherry的荧光强度增量(3~7.5h)。

 

5. Live-Seq技术对同细胞多次测序
 

Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现,细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化,基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。

 

图5. Live-Seq对细胞的多次提取

j.连续测序的示意图和代表图像;k.Live-Seq的tSNE图;l.整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。

 

6. 总结
 

Live-Seq是种十分具有前景的单细胞测序的新方法,得益于FluidFM技术的无损提取的势,Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外,还降低了细胞的损伤,能够提供更加原生和真实的测序信息。这种点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高,将为单细胞测序技术带来更多可能。

 

参考文献:

[1]. Genome-wide molecular recording using Live-seq, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Riccardo Dainese, Pernille Yde Rainer, Magda Zachara, Christoph G. Gäbelein, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, bioRxiv 2021.03.24.436752;

DOI: https://doi.org/10.1101/2021.03.24.436752

 

相关产品:

 

1、多功能单细胞显微操作系统- FluidFM BOT

  • 联系电话电话010-85120887
  • 传真传真010-85120276
  • 邮箱邮箱info@qd-china.com
  • 地址公司地址北京市朝阳区酒仙桥路10号 恒通商务园B22座 501 室
© 2022 版权所有:QUANTUM量子科学仪器贸易(北京)有限公司   备案号:京ICP备05075508号-3   sitemap.xml   管理登陆   技术支持:化工仪器网       
  • 公众号二维码

联系我们

contact us

联系我们时,请告知是化工仪器网上看见的

返回顶部